國內分子診斷主要技術

（一）國內比較有特色的技術

一步法PCR檢測技術

“一步法PCR檢測技術”是國內一項具有自主知識產權的在國際上也是獨有的技術，利用快速核酸釋放技術，省去了加熱、離心、移液、換管等操作，樣本處理時間比同類產品大大縮短。樣本處理與PCR擴增在一個PCR反應管中即可完成，只需微量樣本即可實現高靈敏度檢測，不但檢測成本低，大大降低了對操作人員的要求，易于分子診斷的應用普及，利于自動化大批量樣本處理，適合大型疾病如HBV、HPV篩查等應用。同時一步法技術可以給分子診斷的即時檢測平臺（POCT）提供最簡潔快速的核酸檢測方案，極大的簡化檢測裝置和流程，確保分子診斷即時檢測平臺的移動性和時效性，在家用檢測、危急病人實時檢測、重大疫情的防控有著獨特優勢。

帶磁珠擴增的磁珠法PCR檢測技術

對比于傳統的煮沸法，柱提法等核酸提取技術，國內自主開發的國際領先的第五代磁珠法核酸提取技術，通過超順納米磁珠富集樣本中的核酸分子，在常溫下裂解病原體，無需加熱煮沸、離心，磁珠不需洗脫核酸，可帶磁珠進行PCR擴增，簡化操作步驟，靈敏度高、線性范圍寬、可重復性好、抗干擾能力強，可實現自動化的PCR定量檢測。在乙肝檢測方面，靈敏度可達到國際領先的5-10 IU/mL，滿足臨床對病毒性肝炎感染進行早期診斷、病毒學應答、耐藥監測、療效觀察及預后評估的需求。

集成自動化及微流控技術

體外診斷的自動化目前主要技術為機械手臂和微流控技術兩類。這兩類儀器各有特色和優勢，活躍在不同的應用場景?；谖⒘骺丶夹g的體外診斷儀器往往全自動化集成，操作也比較簡易。但是，相對機械手臂式的儀器而言，單個樣品檢測成本可能會較高。國內開發了集成全自動化機械臂和微流控芯片技術用于分子診斷的產品，利用機械臂的精準移液操作，并結合微流控技術制備的檢測芯片，可以實現全自動化的核酸提取、擴增、雜交檢測全過程，實現sample-to-answer的檢測模式，同時可實現樣本的多重檢測?；谠撃Ｊ?，可以完成對病原體多型別的檢測，比如HPV分型檢測。

Super-ARMs PCR技術

突變擴增阻滯系統（amplification refractory mutation system，ARMS）是目前國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最廣泛應用的技術之一，其在臨床應用中的優勢已被業內專家廣泛認可。廈門艾德自主研發的“Super-ARMS”是ARMS技術的升級版，保留了ARMS技術簡便、快速、特異性好、易普及等特點，同時進一步提高檢測靈敏度（靈敏度可達0.2%），用于臨床檢測晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者血液ctDNA中EGFR基因突變狀態，篩選適合接受一代至三代EGFR靶向藥物治療的患者。

(二) 自動化核酸提取技術

核酸提取儀是應用配套的核酸提取試劑來自動完成樣本核酸的提取工作的儀器，目標用戶通常為對標準化、質量改進和對自動化感興趣的分子診斷和研究實驗室，涉及核酸提取實驗的小型、中型和大型實驗室。最早將全自動核酸提取儀投入到市場的是羅氏公司，近幾年來，開發核酸提取儀器的廠家如雨后春筍，國內的廠家主要有達安、圣湘、天隆、之江、安普利，國外的廠家有羅氏、雅培、凱杰、珀金埃爾默等。2017年市面上的各種核酸提取儀器得到了非常大的應用和推廣。

按照核酸提取儀的功能大小，核酸提取儀分為兩類：一類是大型的全自動化的核酸提取儀，一般稱為自動液體工作站，樣本試劑全部加在儀器上自動化處理；另一類是小型自動核酸提取儀，也稱半自動核酸提取儀，利用封裝好的配套試劑，手動加入樣本，然后放置在儀器中自動完成提取純化過程。自動液體工作站是功能比較全面的設備，液體分液、吸液等自動完成，有的甚至可以整合擴增、檢測等功能，做到了樣本進結果出，一次提取的樣本量非常大，一般提取的通量在96個到幾百個標本不等。小型的自動化儀器是通過運行結構的特殊設計達到自動提取核酸的目的，儀器設備和運行成本低，操作簡單方便，一次提取24-48個樣本不等。目前臨床檢驗醫學檢測樣本類型主要有血清、血漿、分泌物、脫落細胞、咽拭子、肛拭子、尿液、糞便、痰液、全血、組織、石蠟切片等十多種，不同的分析系統和試劑的核酸提取操作方式不一致，導致臨床操作繁瑣，容易出現操作誤差，影響臨床報告的準確性。國內有廠家率先開發了一種統一提取試劑，在其自動液體工作站上可以同時提取多種樣本類型，簡化核酸提取的操作，為下游的應用揭開了廣闊的前景。

(三) 數字PCR

20世紀末，Vogelstein 等提出數字PCR(digital PCR，dPCR)的概念，即通過將一個樣本分成大量等份，然后分配到不同的獨立反應，每個獨立反應單元至少包含一個拷貝的目標分子(核酸模板)，在每個獨立反應的中分別對目的模板分子進行PCR擴增，然后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。

當前數字PCR主要采用微流控芯片或微滴化方法，將核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴反應單元中，每個反應的核酸模板數少于或者等于1個。經過PCR之后，含有核酸分子模板的反應就會產生熒光信號，沒有模板的反應就沒有熒光信號。根據相對比例和反應單元的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。目前數字PCR主要在癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物檢測、基因表達分析以及拷貝數變異分析等科研領域有較廣泛的應用，同時也可以與高通量測序無縫對接，驗證測序結果。

2017年4月21日，國家食品藥品監督局同意南京科維思公司的芯片式數字PCR分析系統進入新一批創新醫療器械特別審批申請項目名單（“綠色審批通道”）。該款產品有望率先獲得國家食品藥品監督管理局認證，成為國內首款基于數字PCR的臨床級檢測產品。

(四) 國內測序技術

2017年，國內廠家新推出了GenoCare、MGISEQ-200、MGISEQ-2000等幾款國產測序儀。2017年1月，國家食品藥品監督管理局批準了DA8600高通量基因測序儀適應范圍變更，由原來的“僅用于胎兒染色體21三體、18三體、13三體的非整倍體檢測”擴展為“用于胎兒染色體21三體、18三體、13三體的非整倍體檢測，人體基因位點的檢測”。2017年03月，國家食品藥品監督管理局批準了基因測序儀NextSeq 550AR和胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）的醫療器械產品注冊。2017年12月，BGISEQ-50基因測序儀獲得國家醫療器械注冊證。

2017年11月，北京大學黃巖誼教授團隊開發了一項被稱為ECC（Error-Correction Code）測序的新技術，發表在Nature Biotechnology上。該技術是基于信息理論來修正錯誤的高準確度熒光DNA測序方法，將使高通量測序儀的精準度進一步大幅提升。通過實驗室樣機的測試，測序讀長可以達到250bp，其中前200個堿基的準確率可達100%。這一新型測序儀創造性地結合了“熒光發生”和“糾錯編碼”技術，測序結果將具有更精準、更高效、更經濟的顯著特點，將為國產高端醫療設備制造和市場應用帶來新鮮血液。

2017年，國產BGISEQ-500平臺的通用測序儀及其配套試劑、NIFTY檢測試劑盒及核酸提取試劑盒均獲得了歐盟醫療器械CE Mark認證。這意味著由中國智造的高通量測序儀及其產品滿足了歐洲體外診斷器械相關指令的法規要求，有望獲得更多推廣。

(五) 微生態研究

按照正常微生物群所占的空間不同，人類微生態系統分為以下幾類，即人類口腔微生態系統、胃腸道微生態系統、泌尿道微生態系統、生殖道微生態系統、皮膚微生態系統、呼吸道微生態系統。其中腸道微生態與疾病的相關性研究成為2017年的科研熱點，已經報道了腸道細菌多樣性與克羅恩病、糖尿病、心腦血管病、結直腸癌等疾病具有很高的相關性，例如在結直腸癌患者的腸道中能特異性的檢出具核梭桿菌含量增高。同時也有研究報道顯示腸道細菌菌群構成與癌癥的用藥治療、化療效果具有相關性，為癌癥的個體化治療提供一個新思路。不過目前腸道微生態的臨床研究還處于科研階段，仍然需要更多數據支撐來明確臨床診斷的意義。

2017年6月20日，《Nature Medicine》刊文關于發現抑制肥胖的腸道微生物——多形擬桿菌。上海交通大學瑞金醫院的寧光院士、王衛慶教授團隊，以中國的漢族年輕人為研究對象,研究發現肥胖人群中谷氨酸的含量非常高，與苗條人群形成顯著差異，并且在肥胖人群中谷氨酸的含量與多形擬桿菌的數量呈反比。通過對小鼠移植多形擬桿菌的動物實驗，以及分析23名接受過袖狀胃切除術的志愿者的腸道微生物得到進一步驗證，從研究上預示著通過腸道微生物來治療肥胖是可行的。

(六) 無創產前單基因病檢測技術

隨著高通量測序技術的發展及推廣，無創產前基因檢測技術（NIPT）在臨床上得到了廣泛的應用，為唐氏綜合癥等染色體變異的篩查提供了精準、便捷的解決方案。但NIPT技術僅篩查染色體層面的變異檢測，而不涉及導致出生缺陷的另一大類因素---單基因遺傳病，單基因病種類繁多，綜合發病率高，對人類健康造成嚴重損傷（致死、致殘或致畸），而且缺乏有效診治手段，一旦發生會給社會以及家庭造成沉重的負擔。

為解決無創產前單基因病檢測方面的技術缺陷，香港中文大學盧煜明教授與美國新型測序公司10X Genomics聯合，應用10X Genomics的Linked Read技術對父母雙方基因組單倍型分型，并對單基因病突變位點附近有效單核苷酸多態性（SNP）進行區分，之后通過對母親外周血DNA進行測序，推斷胎兒是否存在相關遺傳突變。該技術可以對單基因病進行無創產前檢測，可以用一種方法完成對多種單基因病的檢測，是無創產前基因檢測技術應用的一大突破。

(七) 感染病原體測序

感染性疾病的病原種類繁多，傳統的血清學、培養等手段在鑒定感染性疾病的病原方面耗時費力，難以及時的給臨床提供可靠的診斷依據，使得不少感染性病患者未能得到及時有效的治療，導致預后不良。國內公司采用高通量宏基因組測序技術對病原體感染患者提供基因檢測，通過微生物專業數據庫比對和智能化算法分析，獲得疑似致病微生物種屬信息，可以為疑難危重感染患者提供快速精準診斷依據，促進抗生素合理使用。該檢測可協助臨床快速鑒定并明確患者的感染病原體，特別是對未知或者無法培養的病原有獨特優勢。對感染病原體進行定性定量的同時，實現病原體基因組變異的檢測，研究病原體隨時間的變異情況，有助于疫情起源追蹤與疫情監測，可以發現新的病原體，是院內感染控制和社區感染暴發調查的有力手段。

來源：《中國體外診斷產業發展藍皮書》